Resumo Novas abordagens para o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados, resistentes a doenças, incluem alvos específicos de expressão gênica, visando a aumentar as chances de controle do patógeno. A expressão gênica, induzida por promotores de genes de Citrus sinensis, derivados do floema, poderia ser avaliada e comparada com aquela induzida por um promotor constitutivo no mesmo tecido, levando à produção de laranjas-doces transgênicas, potencialmente mais resistentes a doenças causadas por bactérias de floema. Plantas de citrange ‘Carrizo’ [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] foram transformadas, via Agrobacterium tumefaciens, com o vetor binário pCAMBIA2301 contendo o gene uidA (ß-glucuronidase), dirigido pelo promotor constitutivo CaMV35S (CaMV35S :: uidA) ou pelos promotores de citros CsPP2.B1 (CsPP2 .B1 :: uidA) ou CsVTE2 (CsVTE2 :: uidA). Brotos regenerados in vitro foram enxertados em limão ‘Cravo’ (C. limonia Osbeck). A transformação genética foi confirmada por análises de Southern blot. A expressão do gene uidA foi avaliada por RT-qPCR, e a histolocalização do gene, dirigida por esses três promotores, foi acessada por seções de ramos tratadas com X-GLUC. A expressão do gene uidA, exibida por promotores específicos de tecido, foi, em geral, menor do que a do promotor constitutivo CaMV35; no entanto, as construções dirigidas por promotores específicos de tecido podem levar à expressão em tecidos restritos. Os promotores CsPP2.B1 e CsVTE2 podem ser considerados adequados para utilização em construções gênicas, visando à resistência a doenças.

Abstract New approaches for developing disease-resistant genetically modified organisms have included specific targets for gene expression to enhance the chances for pathogen control. Gene expression driven by phloem-derived Citrus sinensis gene promoters could be evaluated and compared with the expression induced by a strong constitutive promoter in the same tissue, leading to the production of transgenic sweet oranges potentially more resistant to diseases caused by phloem-limited bacteria. ‘Carrizo’ citrange [ (Poncirus trifoliataL.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] was transformed, via Agrobacterium tumefaciens, with the binary vector pCAMBIA2301 bearing the uidA gene (ß-glucuronidase) driven by the CaMV35S constitutive promoter (CaMV35S::uidA) or by the CsPP2.B1 (CsPP2.B1::uidA) or by the CsVTE2 (CsVTE2::uidA) citrus promoters. In vitro regenerated shoots were grafted onto ‘Rangpur’ lime (C. limonia Osbeck). The genetic transformation was confirmed by Southern blot analyses. uidA gene expression was evaluated by RT-qPCR, and gene histolocalization controlled by these three promoters was accessed by X-GLUC treated stem sections. uidA gene expression exhibited by tissue-specific promoters was overall lower than from the constitutive promoter CaMV35; however, constructs driven by tissue-specific promoters may lead to expression in restricted tissues. CsPP2.B1 and CsVTE2 promoters can be considered adequate for the utilization in gene constructs aiming disease resistance.

RESUMO A utilização de promotores preferencialmente expressos em tecidos vegetais específicos é uma estratégia desejável na busca por resistência a patógenos que colonizam tais tecidos. A bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), associada à doença huanglongbing (HLB) em citros, coloniza o tecido floemático. Alguns promotores, além de conferir expressão específica em certos tecidos, podem também responder diferencialmente à presença de patógenos. O objetivo deste estudo foi verificar se a presença de Las poderia modular a ativação dos promotores de floema AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2), AtSUC2 (A. thaliana sucrose transporter 2) e CsPP2 ( pCitrus phloemrotein 2), conhecidos por expressão específica em floema de Citrus sinensis. Plantas de laranja ‘Hamlin’ (Citrus sinensis L. Osbeck) transformadas com o gene reporter uidA (GUS) sob controle dos promotores AtPP2, AtSUC2 e CsPP2 foram infectadas para avaliar a interdependência entre a expressão dos transgenes e concentração de Las. Plantas foram inoculadas com Las por meio de Diaphorina citri e dezoito meses após, a concentração de bactéria e expressão do gene uidA foram determinadas por qPCR e RT-qPCR, respectivamente. A expressão do gene reporter dirigida pelo promotor AtSUC2 foi forte e positivamente correlacionada com a concentração de Las. Portanto, este promotor contém características desejáveis quanto à especificidade de expressão e indução específica por patógeno para a produção de plantas transgênicas tolerantes a Las.

ABSTRACT The use of promoters preferentially expressed in specific plant tissues is a desirable strategy to search for resistance for pathogens that colonize these tissues. The bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), associated with huanglongbing disease (HLB) of citrus, colonizes phloem vessels. Some promoters, besides conferring tissue-specific expression, can also respond to the presence of the pathogen. The objective of the present study was to verify if the presence of Las could modulate the activation of the phloem-specific promoters AtPP2 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2), AtSUC2 (A. thaliana sucrose transporter 2) and CsPP2 ( pCitrus phloemrotein 2), known to be expressed in Citrus sinensis phloem. ‘Hamlin’ sweet orange plants (Citrus sinensis L. Osbeck) transformed with the uidA (GUS) reporter gene under the control of AtPP2, AtSUC2 and CsPP2 promoters were infected to evaluate the interdependence between transgene expression and the concentration of Las. Plants were inoculated with Las by Diaphorina citri and eighteen months later, bacterial concentration and uidA expression were determined by qPCR and RT-qPCR, respectively. Reporter gene expression driven by AtSUC2 promoter was strongly and positively correlated with Las concentration. Therefore, this promoter combines desirable features of both tissue-specificity and pathogen-inducibility for the production of transgenic plants tolerant to Las.

O objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de laranja 'Pêra' e 'Valência' por meio do gene D4E1 dirigido pelo promotor Arabidopsis thaliana phloem protein (AtPP2) e quantificar a expressão dos transgenes nos diferentes eventos de transformação. Os experimentos de transformação genética foram realizados com segmentos de epicótilo cocultivados com Agrobacterium tumefaciens. Seis plantas de laranja 'Pêra' e sete plantas de laranja 'Valência' foram confirmadas como distintos eventos transgênicos por meio das técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e Southern blot. A expressão dos transgenes foi quantificada por PCR quantitativo em tempo real. Os níveis de expressão do gene D4E1 variam de 5 a 50 vezes entre os diferentes eventos de transformação.

The objective of this work was to produce transgenic 'Pêra' and 'Valência' sweet orange plants using the D4E1 gene driven by the Arabidopsis thaliana phloem protein (AtPP2) promoter and to quantify transgene expression in different transformation events. Genetic transformation experiments were carried out with epicotyl segments co‑cultivated with Agrobacterium tumefaciens. Six plants from 'Pêra' sweet orange and seven plants from 'Valência' sweet orange were confirmed as different transgenic events by means of the polymerase chain reaction (PCR) and the Southern blot techniques. Transgene expression was quantified using real‑time quantitative PCR. D4E1 gene expression levels vary from 5 up to 50 times among different transformation events.